组织捣碎匀浆机关于动物固体组织蛋白的提取

　　1.前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管,自然晾干;也可放入烤箱中,速度较快。

　　2.裂解液配制：RIPA:PMSF=100:1,现配现用。置入4℃冰上。

　　3.抽蛋白：

　　适量组织加入裂解液中。

　　匀浆操作。

　　手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6-8分钟),充分研碎,使组织匀浆化。

　　机器匀浆：用JJ-2组织捣碎匀浆机上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10秒/次,间隙30秒,连续3~5次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

　　超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎,可用超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用40安培,5秒/次,间隙10秒反复3-5次。

　　反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆,也可以反复冻溶3次左右(即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰,溶解,再结冰,再溶解,反复3次左右),但有部分酶活力会受影响。

　　将组织匀浆转入1.5ml的EP管中(离心管)。12000r/min 4°C离心15min。

　　离心后EP管中液体分三层,提取中间无色液相,移入新的EP管中。可-80℃保存。

　　大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中,化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化,这一变化可由分光光度计或酶标仪检测,并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。如果样品数量较多,可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。